大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷*的定點誘變僅需進行2輪PCR反應即可獲得，...

問題詳情：

大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷*的定點誘變僅需進行2輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。請分析回答下列問題：

（1） 引物結合到互補DNA鏈時的溫度稱退火溫度，常規PCR設定的退火溫度通常是____。爲了使兩輪PCR反應在同一支試管中進行，引物設計時應考慮不同的退火溫度，第二輪PCR的退火溫度應該比第一輪____，第二輪PCR仍需加入的引物是____。

（2） PCR擴增的定點誘變產物通常需要連接到載體分子上才能表達出相應的*狀，該定點誘變產物需具備____等結構才能進行轉錄和翻譯。新發現UGA（終止密碼子）可以對應一種新的氨基*，下圖是已轉錄出的mRNA部分鹼基序列，預測虛線框後的第一個密碼子最多有____種。

（3） 欲將某功能蛋白的第17位Cys（UGU）改造成Ser（UCU），應將誘變引物設計包含____序列，該過程屬於____技術範疇。

【回答】

55-60℃    高    （另一種）側翼引物    啓動子和終止子    14    –AGA-或-TCT-    蛋白質工程   

【分析】

PCR技術：

概念：PCR全稱爲聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外複製特定DNA的核*合成技術。

原理：DNA複製。

前提條件：要有一段已知目的基因的核苷*序以便合成一對引物。

條件：模板DNA、四種脫氧核苷*、一對引物、熱穩定DNA聚合酶(Taq酶)。

過程：①高溫變*：DNA解旋過程；②低溫復*：引物結合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。

PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下*鍵可自動解開

【詳解】

（1）PCR中退火的溫度要求爲55-60℃；第二輪PCR會在同一支試管裏以第一輪的產物作爲擴增引物，因此退火溫度需要設置的更高，以防止第一輪的引物結合到DNA上；第二輪PCR仍然需要加入另一種側翼引物，以便進行另一條鏈的延伸。

（2）若要使得目的基因可以表達出蛋白質，則需要在產物上具備啓動子和終止子，誘導基因轉錄；每三個相鄰的鹼基決定一個氨基*，被稱爲一個密碼子，AUG是起始密碼子，因此圖中虛線框後的字母U是一個密碼子的第一個鹼基，由題意可知該位置不能不對應氨基*，不對應氨基*的終止密碼子本來有3種，現在UGA（終止密碼子）可以對應一種新的氨基*，因此可能的密碼子有4×4-3+1=14種。

（3）由於Ser的密碼子爲UCU，因此再設計PCR引物（本質爲DNA）時，需要包含–AGA-（作爲模板鏈）或-TCT-（作爲非模板鏈），該項技術屬於蛋白質工程。

【點睛】

本題的難點是結合PCR的原理和過程推斷大引物PCR定點突變的大致原理和過程，易錯點是對所給虛線框後鹼基構成密碼子種類的考察，識記密碼子的種類和終止密碼子的數目，及對該題中編碼氨基*的要求進行合適的分析是該易錯點的解題方法。

知識點：DNA和蛋白質技術

題型：綜合題